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DNA的合成、组装及转移技术

发布时间:2019-06-15 22:55 来源:未知 编辑:admin

  中国网/中国发展门户网讯 随着测序技术的发展及测序成本的降低,越来越多物种的基因组被测序,人类对生物基因组的测序“读取”取得了空前的突破。而随着 DNA 合成技术及基因编辑技术的发展,人类“编写”生物基因组也逐渐成为现实。基因组的编辑,甚至全基因组的重设计与合成,一方面可以作为研究手段探索基因的功能,促进功能基因组学的发展;另一方面则可以获得新的生命体用于疾病治疗、药物生产等,服务人类。全基因组的从头合成作为当前合成生物学研究的热点之一,其涉及基因组的从头设计、构建和功能表征等,属于自下而上的生物学研究策略。新生命体系的从头设计与合成不仅需要合成组成基因组的小片段 DNA 片段,还需要通过后续的组装与拼接获取完整的合成基因组,随后还涉及合成基因组往宿主细胞的转移及功能分析。DNA 合成及基因组拼装、转移技术是合成基因组学乃至整个合成生物学领域的核心技术体系,其突破将极大地推动合成生物学的发展。

  DNA 合成技术是合成基因组学,乃至现代分子生物学的根基。PCR(聚合酶链式反应)或者酶切手段只局限于获得自然界已有的 DNA 片段,而 DNA 的从头合成则可以通过 Oligo(寡链核苷酸)的拼接获得人工设计的特定 DNA 片段。如何提高 Oligo 合成的长度和效率、降低合成成本是后续进行大规模基因组合成的关键突破点。根据合成原理,目前 Oligo 的合成方法可分为已经成熟并商业化的化学法和正在研发中的酶促合成法。

  Oligo 的化学合成研究始于 20 世纪 50 年代,Michelson 和 Todd首次报道采用磷酸二酯法实现了寡聚二核苷酸的合成。到 20 世纪 80 年代,Beaucage 和 Caruthers开发了基于亚磷酰胺的 DNA 合成法,也是今天 Oligo 自动化生产所采用的主要方法。该方法包括去保护、偶联、加帽(可选)及氧化 4 个步骤(图 1)。由于随着链延长所带来的化学反应效率、合成纯度以及产率的下降,目前该方法合成的 Oligo 长度一般不超过 200 个核苷酸(nt)。为了提高通量,从 20 世纪 90 年代开始发展起来的基于微阵列芯片的 DNA 合成策略,使得合成成本降低了若干个数量级。然而由于芯片特有的不均一性及边缘效应等原因,相较于柱法合成,芯片法合成在长度、准确性方面均有所下降。为了增加芯片合成的精确度,2010 年 Kosuri 等和 Matzas 等分别采用不同的技术策略,从各异的芯片产物中挑选出正确合成的寡核苷酸原料。Kosuri 采用了多重 PCR 策略,选择性扩增目的寡核苷酸片段,结合酶促纠错等方法,可以合成长度超过 200 nt 的寡核苷酸原料,实现了更大规模和更高精度的合成;Matzas 等则是借助 454 测序仪,先通过测序挑选出序列正确的寡核苷酸产物,然后对这些产物进行大量扩增,从而使得样品的错误率降低到基本可以忽略。

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